Laboratorio #2 Tinci贸n De Gram
Integrantes:
Joicelne Justavino 8-995-1541
Marlenis Gonz谩lez 8-885-653
Julissa Liu 8-989-1420
Beatriz Villareal 4-812-756
Luis Caballeros 4-780-487
Jaqueline Gan 8-969-487
Carmen Pinz贸n 2-737-1836
Yovelis Navarro 8-902-1932
Karen Atencio
Ida Vergara 8-900-1483
Jair De Frias 7-712-2043
Objetivo
El alumno aplicar谩 una t茅cnica de coloraci贸n diferencial para la identificaci贸n de bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Material
Asa de platino Cultivos de Escherichia
coli
Microscopio Cultivo de
Staphylococcus aureus
Porta objetos Cultivo de C谩ndida
albicans
Aceite de inmersi贸n Esputo de tuberculoso procesado en autoclave
Sustancias Colorantes
Colorante violeta cristal de Gram Soluci贸n decolorante alcohol acetona Safranina de Gram
Yodo de Gram o lugol para gram
Introducci贸n
Tinci贸n De Gram: Tinci贸n empleada en microbiolog铆a para la visualizaci贸n de bacterias en muestras cl铆nicas. Tambi茅n se emplea como primer paso en la diferenciaci贸n bacteriana. El examen con microscopio 贸ptico de preparaci贸n con tinci贸n de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las formas comunes son cocos (esf茅ricas), bacilos (alargadas) y formas espiraladas. Las bacterias pueden diferenciarse con esta tinci贸n en dos grupos. Los microorganismos Gram positivos se ti帽en de azul, mientras que aproximadamente
un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos espira lados se ti帽en de rojo y se dice que son gramnegativos.
Las aplicaciones m谩s comunes de la coloraci贸n de Gram son las siguientes:
La presencia de cocos grampositivos agrupados sugiere estafilococos; en cadenas sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos
La presencia de diplococos gramnegativos son caracter铆sticas de especies de Neisseria.
Los bacilos Gram positivos grandes sugieren especies de Bacillus o clostridium, los bacilos Gram positivos peque帽os sugieren especies de Listeria o una de las corineiformes ( difteroides).
Los bacilos Gram negativos son las bacterias m谩s comunes halladas en los laboratorios cl铆nicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no fermentados y especies de Haemophilus.
El valor diagn贸stico de esta tinci贸n es variable; normalmente permite una buena orientaci贸n al microbi贸logo para seleccionar las t茅cnicas de cultivo m谩s adecuadas y tambi茅n tiene valor en orientar hacia un diagn贸stico etiol贸gico, en especial para instaurar un tratamiento inicial.
Procedimiento
Colocar una peque帽a gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una m铆nima gota de agua, que resulta suficiente.
Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones as茅pticas, una peque帽a cantidad del cultivo bacteriano en medio s贸lido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensi贸n homog茅nea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio l铆quido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensi贸n bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.
Esperar hasta que el l铆quido se evapore o acelerar su evaporaci贸n acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precauci贸n de no calentar demasiado el porta pues las c茅lulas pueden deformarse o romperse.
Tinci贸n De Gram
Realiza la preparaci贸n del frotis bacteriano como se explic贸 en el paso anterior
Te帽ir con cristal violeta 3 min.
Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
Cubrir con Lugol 1min.
Lavar con agua el exceso de Lugol.
decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparaci贸n deje de perder color (30seg)
Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
Te帽ir con safranina 2 min.
Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
Secar la preparaci贸n.
Examinar al microscopio con aceite de inmersi贸n y fij谩ndose sobre todo en el color de cada preparaci贸n.
Cuestionario
¿Qu茅 es un frotis?
R/. Un frotis es un mecanismo cient铆fico que consiste en el extendido de una gota en la superficie de un portaobjetos o de un cubreobjetos, con el fin de analizarla posteriormente.
¿Con qu茅 finalidad se fija la muestra de microorganismos en el porta objetos?
R/. Se fija el frotis por calor o por agentes qu铆micos. Con las siguientes finalidades:
Se evita la deformaci贸n de las c茅lulas con el colorante.
Para posicionar las estructuras internas y externas de la c茅lula
Adem谩s se mata al microorganismo.
Preserva la morfolog铆a general pero no las estructuras internas.
Protege la subestructura fina y la morfolog铆a de los microorganismos delicados de mayor tama帽o.
¿Qu茅 importancia tiene te帽ir las muestras bacterianas?
R/. La tinci贸n bacteriana tiene dos prop贸sitos fundamentales:
Identificar la bacteria (Gram positiva o Gran negativa).
Con base en la identificaci贸n, indicar el tratamiento correcto (los antibi贸ticos no funcionan por igual para bacterias Gram positivas que Gram negativas).
¿Por qu茅 es necesario emplear aceite de inmersi贸n para la observaci贸n de los microorganismos?
R/. El aceite de inmersi贸n tiene aproximadamente el mismo 铆ndice de refracci贸n que el vidrio y con 茅l se elimina casi completamente los rayos de la luz y aumenta en gran cantidad la eficacia del uso del microscopio.
De los reactivos que utilizaste para la tinci贸n de Gram, ¿cu谩l es el que funciona como colorante primario?
R/. violeta cristal es el que funciona como colorante primario.
¿Qu茅 funci贸n tiene el Yodo en la tinci贸n de Gram?
R/. El Yodo entra en las c茅lulas y forma un complejo insoluble en soluci贸n acuosa con el cristal violeta. El lugol es un compuesto formado por yodo en equilibrio con yoduro de potasio, el cual est谩 presente para solubilizar el yodo, y act煤a de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la c茅lula bacteriana.
¿Qu茅 coloraci贸n ti帽en las bacterias Gram positivas?
R/. Poseen una pared celular gruesa con numerosas capas de peptidoglucano, las cuales retienen el colorante cristal violeta. Algunas de estas bacterias se rodean adem谩s de una c谩psula o cubierta gruesa y viscosa de polisac谩ridos, azul.
¿Qu茅 coloraci贸n ti帽en las bacterias Gram Negativas?
R/. Poseen una pared celular fina y una segunda membrana lip铆dica denominada membrana externa, la cual no retiene el colorante cristal violeta, como en Escherichia coli, de ah铆 que tome una tonalidad de color rosado.
Menciona tres bacterias que ti帽en Gram positivas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas.
R/. Erisipelotricosis: es una infecci贸n cut谩nea de lento desarrollo causada por la bacteria Erysipelothrix rhusiopathiae.
Listeriosis: es una enfermedad causada por Listeria monocitogenes, da lugar a una sintomatolog铆a diversa de acuerdo con el lugar en que se produce la infecci贸n y la edad de la persona afectada.
脕ntrax: es una enfermedad causada por la bacteria Bacillus anthracis, que puede infectar la piel, los pulmones y el aparato gastrointestinal.
Menciona tres bacterias que ti帽en Gram negativas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas.
R/. Las Enfermedades Vasculares se caracterizan por la invasi贸n de los haces vasculares los cuales se llenan de bacterias y producto.
Las Enfermedades Parenquim谩ticas, aqu铆 Las bacterias invaden los tejidos suculentos y despu茅s de invadir los tejidos vasculares adyacentes provocando tizones, necrosis o manchas foliares. Por ejemplo: Pseudomonas syringae pv. phaseol铆cola.
Las Enfermedades Hiperpl谩sticas, aqu铆 las bacterias invaden cualquier parte de la planta, luego secretan sustancias reguladoras de crecimiento (Auxinas, Giberelinas, etc.), las cuales debido a su adici贸n, a la cantidad normal de la planta, causan aumento y divisi贸n celular normal del tejido afectado, causando excesiva proliferaci贸n de tejidos (tumores) y formaci贸n de 贸rganos adicionale.
Preguntas
1. Cu谩les son las fuentes de errores m谩s comunes de error en la tinci贸n de gran.
Los peores obst谩culos de la Tinci贸n, que impiden conseguir el resultado perseguido, son los errores del t茅cnico. Para evitarlos hay que elegir bien los reactivos y ser muy cuidadosos al ejecutar la t茅cnica. A continuaci贸n describimos algunas de las fuentes de error: Impurezas en los reactivos de Tinci贸n.
• Concentraci贸n inadecuada de los reactivos de tinci贸n.
• pH inadecuado.
• El colorante se fija a la c茅lula por mecanismos f铆sico-qu铆micos, que se alteran si el Ph no es el apropiado.
• Los colorantes pueden ser 谩cidos, b谩sicos o neutros.
• Tiempo de Tinci贸n incorrecto.
• Temperatura suficiente.
2. Explique que reacci贸n de Gram dar谩n las levaduras. Estos tendr谩n la misma importancia que para las bacterias.
El color depende de la composici贸n de la pared celular de la levadura y no tiene tanta importancia como las bacterias ya que en ellas existe toda una clasificaci贸n por medio del gram lo que no sucede con las levaduras.
3. Explique el fundamento de la tinci贸n negativa realizada en la practica. Que tipo de informaci贸n se obtiene.
La Tinci贸n negativa es el reverso del procedimiento de tinci贸n usual: las c茅lulas se dejan sin te帽ir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las c茅lulas. La Tinci贸n negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las c茅lulas en la microscopia 贸ptica, pero su m谩xima utilidad est谩 en revelar la presencia de c谩psulas alrededor de las c茅lulas bacterianas.
4. Investigue otra t茅cnica de tinci贸n selectiva que permita observar otras estructuras bacterianas.
Las Tinciones Selectivas nos permiten observar estructuras de las c茅lulas gracias a su mayor afinidad por los colorantes utilizados.
5. ¿A qu茅 se debe el distinto comportamiento de las bacterias seg煤n sean Gram+ o Gram-?
El distinto comportamiento en la Tinci贸n se piensa que es debido a las diferentes capas superficiales o paredes de las dos bacterias (Tipos de C茅lulas).
6. ¿Para qu茅 se necesita el aceite de inmersi贸n
El aceite de inmersi贸n tiene un indice de refracci贸n similar al del vidrio (1,5 aprox.) y se utiliza para el objetivo de 100X.
Integrantes:
Joicelne Justavino 8-995-1541
Marlenis Gonz谩lez 8-885-653
Julissa Liu 8-989-1420
Beatriz Villareal 4-812-756
Luis Caballeros 4-780-487
Jaqueline Gan 8-969-487
Carmen Pinz贸n 2-737-1836
Yovelis Navarro 8-902-1932
Karen Atencio
Ida Vergara 8-900-1483
Jair De Frias 7-712-2043
Objetivo
El alumno aplicar谩 una t茅cnica de coloraci贸n diferencial para la identificaci贸n de bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Material
Asa de platino Cultivos de Escherichia
coli
Microscopio Cultivo de
Staphylococcus aureus
Porta objetos Cultivo de C谩ndida
albicans
Aceite de inmersi贸n Esputo de tuberculoso procesado en autoclave
Sustancias Colorantes
Colorante violeta cristal de Gram Soluci贸n decolorante alcohol acetona Safranina de Gram
Yodo de Gram o lugol para gram
Introducci贸n
Tinci贸n De Gram: Tinci贸n empleada en microbiolog铆a para la visualizaci贸n de bacterias en muestras cl铆nicas. Tambi茅n se emplea como primer paso en la diferenciaci贸n bacteriana. El examen con microscopio 贸ptico de preparaci贸n con tinci贸n de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las formas comunes son cocos (esf茅ricas), bacilos (alargadas) y formas espiraladas. Las bacterias pueden diferenciarse con esta tinci贸n en dos grupos. Los microorganismos Gram positivos se ti帽en de azul, mientras que aproximadamente
un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos espira lados se ti帽en de rojo y se dice que son gramnegativos.
Las aplicaciones m谩s comunes de la coloraci贸n de Gram son las siguientes:
La presencia de cocos grampositivos agrupados sugiere estafilococos; en cadenas sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos
La presencia de diplococos gramnegativos son caracter铆sticas de especies de Neisseria.
Los bacilos Gram positivos grandes sugieren especies de Bacillus o clostridium, los bacilos Gram positivos peque帽os sugieren especies de Listeria o una de las corineiformes ( difteroides).
Los bacilos Gram negativos son las bacterias m谩s comunes halladas en los laboratorios cl铆nicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no fermentados y especies de Haemophilus.
El valor diagn贸stico de esta tinci贸n es variable; normalmente permite una buena orientaci贸n al microbi贸logo para seleccionar las t茅cnicas de cultivo m谩s adecuadas y tambi茅n tiene valor en orientar hacia un diagn贸stico etiol贸gico, en especial para instaurar un tratamiento inicial.
Procedimiento
Colocar una peque帽a gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una m铆nima gota de agua, que resulta suficiente.
Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones as茅pticas, una peque帽a cantidad del cultivo bacteriano en medio s贸lido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensi贸n homog茅nea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio l铆quido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensi贸n bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.
Esperar hasta que el l铆quido se evapore o acelerar su evaporaci贸n acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precauci贸n de no calentar demasiado el porta pues las c茅lulas pueden deformarse o romperse.
Tinci贸n De Gram
Realiza la preparaci贸n del frotis bacteriano como se explic贸 en el paso anterior
Te帽ir con cristal violeta 3 min.
Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
Cubrir con Lugol 1min.
Lavar con agua el exceso de Lugol.
decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparaci贸n deje de perder color (30seg)
Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
Te帽ir con safranina 2 min.
Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
Secar la preparaci贸n.
Examinar al microscopio con aceite de inmersi贸n y fij谩ndose sobre todo en el color de cada preparaci贸n.
Cuestionario
¿Qu茅 es un frotis?
R/. Un frotis es un mecanismo cient铆fico que consiste en el extendido de una gota en la superficie de un portaobjetos o de un cubreobjetos, con el fin de analizarla posteriormente.
¿Con qu茅 finalidad se fija la muestra de microorganismos en el porta objetos?
R/. Se fija el frotis por calor o por agentes qu铆micos. Con las siguientes finalidades:
Se evita la deformaci贸n de las c茅lulas con el colorante.
Para posicionar las estructuras internas y externas de la c茅lula
Adem谩s se mata al microorganismo.
Preserva la morfolog铆a general pero no las estructuras internas.
Protege la subestructura fina y la morfolog铆a de los microorganismos delicados de mayor tama帽o.
¿Qu茅 importancia tiene te帽ir las muestras bacterianas?
R/. La tinci贸n bacteriana tiene dos prop贸sitos fundamentales:
Identificar la bacteria (Gram positiva o Gran negativa).
Con base en la identificaci贸n, indicar el tratamiento correcto (los antibi贸ticos no funcionan por igual para bacterias Gram positivas que Gram negativas).
¿Por qu茅 es necesario emplear aceite de inmersi贸n para la observaci贸n de los microorganismos?
R/. El aceite de inmersi贸n tiene aproximadamente el mismo 铆ndice de refracci贸n que el vidrio y con 茅l se elimina casi completamente los rayos de la luz y aumenta en gran cantidad la eficacia del uso del microscopio.
De los reactivos que utilizaste para la tinci贸n de Gram, ¿cu谩l es el que funciona como colorante primario?
R/. violeta cristal es el que funciona como colorante primario.
¿Qu茅 funci贸n tiene el Yodo en la tinci贸n de Gram?
R/. El Yodo entra en las c茅lulas y forma un complejo insoluble en soluci贸n acuosa con el cristal violeta. El lugol es un compuesto formado por yodo en equilibrio con yoduro de potasio, el cual est谩 presente para solubilizar el yodo, y act煤a de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la c茅lula bacteriana.
¿Qu茅 coloraci贸n ti帽en las bacterias Gram positivas?
R/. Poseen una pared celular gruesa con numerosas capas de peptidoglucano, las cuales retienen el colorante cristal violeta. Algunas de estas bacterias se rodean adem谩s de una c谩psula o cubierta gruesa y viscosa de polisac谩ridos, azul.
¿Qu茅 coloraci贸n ti帽en las bacterias Gram Negativas?
R/. Poseen una pared celular fina y una segunda membrana lip铆dica denominada membrana externa, la cual no retiene el colorante cristal violeta, como en Escherichia coli, de ah铆 que tome una tonalidad de color rosado.
Menciona tres bacterias que ti帽en Gram positivas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas.
R/. Erisipelotricosis: es una infecci贸n cut谩nea de lento desarrollo causada por la bacteria Erysipelothrix rhusiopathiae.
Listeriosis: es una enfermedad causada por Listeria monocitogenes, da lugar a una sintomatolog铆a diversa de acuerdo con el lugar en que se produce la infecci贸n y la edad de la persona afectada.
脕ntrax: es una enfermedad causada por la bacteria Bacillus anthracis, que puede infectar la piel, los pulmones y el aparato gastrointestinal.
Menciona tres bacterias que ti帽en Gram negativas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas.
R/. Las Enfermedades Vasculares se caracterizan por la invasi贸n de los haces vasculares los cuales se llenan de bacterias y producto.
Las Enfermedades Parenquim谩ticas, aqu铆 Las bacterias invaden los tejidos suculentos y despu茅s de invadir los tejidos vasculares adyacentes provocando tizones, necrosis o manchas foliares. Por ejemplo: Pseudomonas syringae pv. phaseol铆cola.
Las Enfermedades Hiperpl谩sticas, aqu铆 las bacterias invaden cualquier parte de la planta, luego secretan sustancias reguladoras de crecimiento (Auxinas, Giberelinas, etc.), las cuales debido a su adici贸n, a la cantidad normal de la planta, causan aumento y divisi贸n celular normal del tejido afectado, causando excesiva proliferaci贸n de tejidos (tumores) y formaci贸n de 贸rganos adicionale.
Preguntas
1. Cu谩les son las fuentes de errores m谩s comunes de error en la tinci贸n de gran.
Los peores obst谩culos de la Tinci贸n, que impiden conseguir el resultado perseguido, son los errores del t茅cnico. Para evitarlos hay que elegir bien los reactivos y ser muy cuidadosos al ejecutar la t茅cnica. A continuaci贸n describimos algunas de las fuentes de error: Impurezas en los reactivos de Tinci贸n.
• Concentraci贸n inadecuada de los reactivos de tinci贸n.
• pH inadecuado.
• El colorante se fija a la c茅lula por mecanismos f铆sico-qu铆micos, que se alteran si el Ph no es el apropiado.
• Los colorantes pueden ser 谩cidos, b谩sicos o neutros.
• Tiempo de Tinci贸n incorrecto.
• Temperatura suficiente.
2. Explique que reacci贸n de Gram dar谩n las levaduras. Estos tendr谩n la misma importancia que para las bacterias.
El color depende de la composici贸n de la pared celular de la levadura y no tiene tanta importancia como las bacterias ya que en ellas existe toda una clasificaci贸n por medio del gram lo que no sucede con las levaduras.
3. Explique el fundamento de la tinci贸n negativa realizada en la practica. Que tipo de informaci贸n se obtiene.
La Tinci贸n negativa es el reverso del procedimiento de tinci贸n usual: las c茅lulas se dejan sin te帽ir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las c茅lulas. La Tinci贸n negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las c茅lulas en la microscopia 贸ptica, pero su m谩xima utilidad est谩 en revelar la presencia de c谩psulas alrededor de las c茅lulas bacterianas.
4. Investigue otra t茅cnica de tinci贸n selectiva que permita observar otras estructuras bacterianas.
Las Tinciones Selectivas nos permiten observar estructuras de las c茅lulas gracias a su mayor afinidad por los colorantes utilizados.
5. ¿A qu茅 se debe el distinto comportamiento de las bacterias seg煤n sean Gram+ o Gram-?
El distinto comportamiento en la Tinci贸n se piensa que es debido a las diferentes capas superficiales o paredes de las dos bacterias (Tipos de C茅lulas).
6. ¿Para qu茅 se necesita el aceite de inmersi贸n
El aceite de inmersi贸n tiene un indice de refracci贸n similar al del vidrio (1,5 aprox.) y se utiliza para el objetivo de 100X.
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